ساخت ناقل rnai اختصاصی زیر واحد گاما گلیادین گندم

rnai به سرعت جایگاه خود را به عنوان یک ابزار مهندسی ژنتیک معکوس جهت خاموشی بیان ژن های هدف در گیاهان به دست آورده است. توانایی هدف گیری اعضای خانواده چندگانه ژنی توسط یک ژن تراریخت القا کننده rnai از جمله ویژگی این روش به شمار می رود. در حالی که جهش های حاصل از حذف و اضافه شدن قابل بازگشت هستند، غالبیت rnai در خاموشی ژن ها یکی دیگر از ویژگی های آن به شمار می رود. فناوری در حال حاضر جهت القای rnai در گیاهان، برگرفته از کشف خاموشی موثر ژن هدف از طریق بیان یک توالی mrna حاوی توالی تکراری معکوس می باشد. گاما گلیادین ها، از جمله مهمترین زیر واحد های گلوتن می باشند که بالغ بر 12 درصد پروتئین های گندم هگزاپلوئید را به خود اختصاص می دهند. در چندین دسته بندی اختصاصی صورت گرفته، مشاهده گردیده است که اغلب مبتلایان به بیماری سلیاک نسبت به پپتید های گاما گلیادین واکنش نشان می دهند. فناوری rnai می تواند به عنوان یک ابزار موثر جهت دستکاری بیان ژن گاما گلیادین و کاهش هسته های اپیتوپی بیماری سلیاک برگرفته از خانواده چندگانه ژنی گاما گلیادین در گندم معمولی و سایر گونه های نزدیک مرتبط با آن مورد استفاده قرار گیرد. بنابراین، شناسایی و همسانه سازی ناحیه تکرارپذیر domain ii مربوط به ژن گاما گلیادین، اولین گام در جهت ساخت ناقل rnai ژن گاما گلیادین می باشد. فلذا، تمام توالی های مربوط به ژن گاما گلیادین توسط نرم افزار blastn شناسایی شده و از پایگاه genbank موجود در ncbi استخراج گردید. dna کل ژنومی توسط روش ctab از برگ های تازه گیاه گندم استخراج شد. آغازگرهای اختصاصی طراحی گردیده و جهت جداسازی نواحی اختصاصی ژن گاما گلیادین مورد استفاده قرار گرفت. قطعه تکثیر شده توسط واکنش pcr در ژل آگارز 8/0 درصد جداسازی شده و توسط کیت تخلیص از ژل، خالص گردید. قطعه تخلیص شده، در داخل ناقل ptg19-t همسانه سازی شده، سپس به سلول های باکتریایی مستعد e.coli سویه dh5? تراریخت گردید. کلنی های تراریخت، توسط سیستم آبی/ سفید غربال شدند. تخلیص کلنی های سفید مثبت، توسط کلنی pcr انجام گردید. پلاسمید های نوترکیب موجود در کلنی های pcr مثبت توسط روش استخراج پلاسمید لیز قلیایی، استخراج شده و پلاسمیدهای نوترکیب با خلوص بالا توسط شرکت bioneer توالی یابی گردیدند. قطعه توالی یابی شده در یک مقایسه گسترده با سایر توالی های گاما گلیادین مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت و توالی اسید آمینه ای آن جهت تعیین نواحی اپیتوپی شناسایی گردید. آغازگرهای اختصاصی برای قطعه کوچک معکوس طراحی شده و پس از تکثیر قطعه معکوس کوچک، پلاسمید های نوترکیب توسط آنزیم های برشی، برش داده شده و قطعه کوچک معکوس در ناقل پلاسمیدی نوترکیب همسانه سازی گردید. در خاتمه، یک ناقل rnai ژن گاما گلیادین گندم محتوی هسته های اپیتوپ بیماری سلیاک ساخته شد.